suppressMessages(library(minfi))
suppressMessages(library(reshape))
suppressMessages(library(ggplot2))
suppressMessages(library(gridExtra))
suppressMessages(library(RColorBrewer))
suppressMessages(library(here))
suppressMessages(library(binom))
suppressMessages(library(limma))
suppressMessages(library(sva))
suppressMessages(library(pamr))
suppressMessages(library(GEOquery))
suppressMessages(library(GEOmetadb))
suppressMessages(library(dplyr))
suppressMessages(library(lmtest))
suppressMessages(library(gridExtra))
suppressMessages(library(gtools))
suppressMessages(library(rafalib))
options(stringsAsFactors = FALSE)
source(here("scripts","00_pretty_plots.R"))
suppressMessages(source(here("scripts","00_heat_scree_plot_generic.R")))
source(here("scripts","00_EM_array_uniform_background_maximise_betabinom.R"))
gse <- getGEO("GSE141256", GSEMatrix = TRUE)
## Found 3 file(s)
## GSE141256-GPL10904_series_matrix.txt.gz
## Parsed with column specification:
## cols(
## .default = col_character()
## )
## See spec(...) for full column specifications.
## File stored at:
## /tmp/RtmpVf5iGM/GPL10904.soft
## Warning: 92 parsing failures.
## row col expected actual file
## 34604 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE --ILMN_Controls literal data
## 34605 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE --ILMN_Controls literal data
## 34606 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE --ILMN_Controls literal data
## 34607 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE --ILMN_Controls literal data
## 34608 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE --ILMN_Controls literal data
## ..... ....... .................. ............... ............
## See problems(...) for more details.
## GSE141256-GPL13534_series_matrix.txt.gz
## Parsed with column specification:
## cols(
## .default = col_character()
## )
## See spec(...) for full column specifications.
## File stored at:
## /tmp/RtmpVf5iGM/GPL13534.soft
## Warning: 65 parsing failures.
## row col expected actual file
## 485513 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE rs10796216 literal data
## 485514 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE rs715359 literal data
## 485515 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE rs1040870 literal data
## 485516 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE rs10936224 literal data
## 485517 SPOT_ID 1/0/T/F/TRUE/FALSE rs213028 literal data
## ...... ....... .................. .......... ............
## See problems(...) for more details.
## GSE141256-GPL21145_series_matrix.txt.gz
## Parsed with column specification:
## cols(
## .default = col_character()
## )
## See spec(...) for full column specifications.
## File stored at:
## /tmp/RtmpVf5iGM/GPL21145.soft
GSE141256_meta_450K<-pData(gse[[2]]) # 1 is expression 2 is 450K
GSE141256_meta_EPIC<-pData(gse[[3]]) # 3 is EPIC
GSE141256_meta_450K<-GSE141256_meta_450K[,c(1,2,8,10:13,21,24,33)]
GSE141256_meta_EPIC<-GSE141256_meta_EPIC[,c(1,2,8,10:13,21,24,33)]
identical(colnames(GSE141256_meta_EPIC), colnames(GSE141256_meta_450K))
## [1] TRUE
#cd data/published_organoids/GSE141256
#wget 'ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE141nnn/GSE141256/suppl/GSE141256_RAW.tar'
#tar -xvf GSE141256_RAW.tar
path<-"data/published_organoids/GSE141256"
GSE141256_meta_450K$Assay.Name<-paste(GSE141256_meta_450K$geo_accession,"_",GSE141256_meta_450K$title, sep="")
GSE141256_meta_EPIC$Assay.Name<-paste(GSE141256_meta_EPIC$geo_accession,"_",GSE141256_meta_EPIC$title, sep="")
GSE141256_meta_450K$array.id.path <- file.path(here(path), GSE141256_meta_450K$Assay.Name)
GSE141256_meta_EPIC$array.id.path <- file.path(here(path), GSE141256_meta_EPIC$Assay.Name)
GSE141256_meta_450K$sentrix_ID<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_450K), function(x){
strsplit(GSE141256_meta_450K$title[x], "_")[[1]][1]
})
GSE141256_meta_EPIC$sentrix_ID<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_EPIC), function(x){
strsplit(GSE141256_meta_EPIC$title[x], "_")[[1]][1]
})
rgset_450k <- read.metharray(GSE141256_meta_450K$array.id.path, verbose = FALSE)
# Background and dye bias correction with noob thhrough funnorm implemented in minfi
#http://bioconductor.org/help/course-materials/2015/BioC2015/methylation450k.html
MSet.illumina405K <- preprocessFunnorm(rgset_450k, sex=GSE141256_meta_450K$characteristics_ch1.2)
## [preprocessFunnorm] Background and dye bias correction with noob
## Loading required package: IlluminaHumanMethylation450kmanifest
## Loading required package: IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19
## [preprocessFunnorm] Mapping to genome
## [preprocessFunnorm] Quantile extraction
## [preprocessFunnorm] Normalization
GSE141256_beta_450K<-getBeta(MSet.illumina405K)
#Detection pvalue analysis
avg_detPval <- colMeans(detectionP(rgset_450k))
GSE141256_meta_450K$det_pval<-avg_detPval
rgset_EPIC <- read.metharray(GSE141256_meta_EPIC$array.id.path, verbose = FALSE)
class(rgset_EPIC)
## [1] "RGChannelSet"
## attr(,"package")
## [1] "minfi"
reset = updateObject(rgset_EPIC)
class(rgset_EPIC)
## [1] "RGChannelSet"
## attr(,"package")
## [1] "minfi"
# Background and dye bias correction with noob thhrough funnorm implemented in minfi
#http://bioconductor.org/help/course-materials/2015/BioC2015/methylation450k.html
MSet.illuminaEPIC <- preprocessFunnorm(rgset_EPIC, sex=GSE141256_meta_EPIC$characteristics_ch1.2)
## [preprocessFunnorm] Background and dye bias correction with noob
## Loading required package: IlluminaHumanMethylationEPICmanifest
## Loading required package: IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b4.hg19
##
## Attaching package: 'IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b4.hg19'
## The following objects are masked from 'package:IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19':
##
## Islands.UCSC, Locations, Manifest, Other,
## SNPs.132CommonSingle, SNPs.135CommonSingle,
## SNPs.137CommonSingle, SNPs.138CommonSingle,
## SNPs.141CommonSingle, SNPs.142CommonSingle,
## SNPs.144CommonSingle, SNPs.146CommonSingle,
## SNPs.147CommonSingle, SNPs.Illumina
## [preprocessFunnorm] Mapping to genome
## [preprocessFunnorm] Quantile extraction
## [preprocessFunnorm] Normalization
GSE141256_beta_EPIC<-getBeta(MSet.illuminaEPIC)
#Detection pvalue analysis
avg_detPval <- colMeans(detectionP(rgset_EPIC))
GSE141256_meta_EPIC$det_pval<-avg_detPval
grid.arrange(ggplot(GSE141256_meta_450K)+geom_boxplot(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, fill=as.factor(sentrix_ID)), outlier.shape = NA)+
geom_point(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, group=geo_accession, fill=as.factor(sentrix_ID)), shape=21, color="black",
position = position_jitter(w = 0.25))+theme_bw()+theme(axis.text.x=element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust=1))+
xlab("Sentrix ID")+ylab("Mean Detection P Value")+guides(fill=FALSE),
ggplot(GSE141256_meta_EPIC)+geom_boxplot(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, fill=as.factor(sentrix_ID)), outlier.shape = NA)+
geom_point(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, group=geo_accession, fill=as.factor(sentrix_ID)), shape=21, color="black",
position = position_jitter(w = 0.25))+theme_bw()+theme(axis.text.x=element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust=1))+
xlab("Sentrix ID")+ylab("Mean Detection P Value")+guides(fill=FALSE))
ggsave(here("figs","GSE141256_detection_pvalue_organoids.pdf"),
grid.arrange(ggplot(GSE141256_meta_450K)+geom_boxplot(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, fill=as.factor(sentrix_ID)), outlier.shape = NA)+
geom_point(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, group=geo_accession, fill=as.factor(sentrix_ID)), shape=21, color="black",
position = position_jitter(w = 0.25))+theme_bw()+theme(axis.text.x=element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust=1))+
xlab("Sentrix ID")+ylab("Mean Detection P Value")+guides(fill=FALSE),
ggplot(GSE141256_meta_EPIC)+geom_boxplot(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, fill=as.factor(sentrix_ID)), outlier.shape = NA)+
geom_point(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, group=geo_accession, fill=as.factor(sentrix_ID)), shape=21, color="black",
position = position_jitter(w = 0.25))+theme_bw()+theme(axis.text.x=element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust=1))+
xlab("Sentrix ID")+ylab("Mean Detection P Value")+guides(fill=FALSE)),
width=6, height=5)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_detection_pvalue_organoids.jpeg"),
grid.arrange(ggplot(GSE141256_meta_450K)+geom_boxplot(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, fill=as.factor(sentrix_ID)), outlier.shape = NA)+
geom_point(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, group=geo_accession, fill=as.factor(sentrix_ID)), shape=21, color="black",
position = position_jitter(w = 0.25))+theme_bw()+theme(axis.text.x=element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust=1))+
xlab("Sentrix ID")+ylab("Mean Detection P Value")+guides(fill=FALSE),
ggplot(GSE141256_meta_EPIC)+geom_boxplot(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, fill=as.factor(sentrix_ID)), outlier.shape = NA)+
geom_point(aes(as.factor(sentrix_ID), det_pval, group=geo_accession, fill=as.factor(sentrix_ID)), shape=21, color="black",
position = position_jitter(w = 0.25))+theme_bw()+theme(axis.text.x=element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust=1))+
xlab("Sentrix ID")+ylab("Mean Detection P Value")+guides(fill=FALSE)),
width=6, height=5)
Beta distribution before and after normalization
# 450K
GSE141256_beta_450K_raw<-getBeta(rgset_450k)
Beta_melted<- melt(GSE141256_beta_450K)
Beta_melted_raw<- melt(GSE141256_beta_450K_raw)
Beta_Plot<-Beta_melted[which(!(is.na(Beta_melted$value))),]
Beta_Plot_raw<-Beta_melted_raw[which(!(is.na(Beta_melted_raw$value))),]
colnames(Beta_Plot)<-c("CpG","ID","Beta")
Beta_Plot<-merge(Beta_Plot,GSE141256_meta_450K, by.x="ID", by.y="Assay.Name")
colnames(Beta_Plot_raw)<-c("CpG","ID","Beta")
Beta_Plot_raw<-merge(Beta_Plot_raw,GSE141256_meta_450K, by.x="ID", by.y="Assay.Name")
beta_dis_450k<-ggplot(Beta_Plot, aes(Beta, group=as.character(geo_accession), color=as.character(description)))+
geom_density()+theme_bw()+xlab("DNAm Beta Value")
beta_dis_450k_raw<-ggplot(Beta_Plot_raw, aes(Beta, group=as.character(geo_accession), color=as.character(description)))+
geom_density()+theme_bw()+xlab("DNAm Beta Value")
# EPIC
GSE141256_beta_EPIC_raw<-getBeta(rgset_EPIC)
Beta_melted<- melt(GSE141256_beta_EPIC)
Beta_melted_raw<- melt(GSE141256_beta_EPIC_raw)
Beta_Plot<-Beta_melted[which(!(is.na(Beta_melted$value))),]
Beta_Plot_raw<-Beta_melted_raw[which(!(is.na(Beta_melted_raw$value))),]
colnames(Beta_Plot)<-c("CpG","ID","Beta")
Beta_Plot<-merge(Beta_Plot,GSE141256_meta_EPIC, by.x="ID", by.y="Assay.Name")
colnames(Beta_Plot_raw)<-c("CpG","ID","Beta")
Beta_Plot_raw<-merge(Beta_Plot_raw,GSE141256_meta_EPIC, by.x="ID", by.y="Assay.Name")
beta_dis_EPIC<-ggplot(Beta_Plot, aes(Beta, group=as.character(geo_accession), color=as.character(description)))+
geom_density()+theme_bw()+xlab("DNAm Beta Value")
beta_dis_EPIC_raw<-ggplot(Beta_Plot_raw, aes(Beta, group=as.character(geo_accession), color=as.character(description)))+
geom_density()+theme_bw()+xlab("DNAm Beta Value")
grid.arrange(beta_dis_450k_raw,beta_dis_450k,beta_dis_EPIC_raw,beta_dis_EPIC)
ggsave(here("figs","GSE141256_beta_distribution.pdf"),grid.arrange(beta_dis_450k_raw,beta_dis_450k,beta_dis_EPIC_raw,beta_dis_EPIC), w=10, h=5)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_beta_distribution.jpeg"),grid.arrange(beta_dis_450k_raw,beta_dis_450k,beta_dis_EPIC_raw,beta_dis_EPIC), w=10, h=5)
# Clustering By sampling site
# remove rows with NAs
GSE141256_450K_betas_cluster<-GSE141256_beta_450K[complete.cases(GSE141256_beta_450K),]
d <- dist(t(GSE141256_450K_betas_cluster))
hc <- hclust(d, method = "complete") #single, complete, average, ward
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_450K$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_450K$description), cex=1.5)
pdf(here('figs','GSE141256_cluster_whole450K_organoid.pdf'), width=30)
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_450K$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_450K$description), cex=1.5)
dev.off()
## png
## 2
Genotyping Probes
SNPs <- getSnpBeta(rgset_450k)
SNPs<-SNPs[complete.cases(SNPs),]
SNPs<-SNPs[,which(colnames(SNPs)%in%GSE141256_meta_450K$Assay.Name)]
identical(colnames(SNPs),GSE141256_meta_450K$Assay.Name)
## [1] TRUE
d <- dist(t(SNPs))
hc <- hclust(d, method = "complete") #single, complete, average, ward
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_450K$geo_accession, lab.col=as.fumeric(as.character(GSE141256_meta_450K$description)), cex=1.5)
pdf(here('figs','GSE141256_cluster_snps_450K.pdf'), width=30)
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_450K$geo_accession, lab.col=as.fumeric(as.character(GSE141256_meta_450K$description)), cex=1.5)
dev.off()
## png
## 2
# https://emea.support.illumina.com/downloads/humanmethylation450_15017482_v1-2_product_files.html
anno_450k<-read.csv(here("data","HumanMethylation450_15017482_v1-2.csv"), skip=7)
anno_450k<-anno_450k[match(rownames(GSE141256_beta_450K),anno_450k$IlmnID),]
identical(rownames(GSE141256_beta_450K),anno_450k$IlmnID)
## [1] TRUE
GSE141256_450K_sex<-GSE141256_beta_450K[which(anno_450k$CHR%in%c('X','Y')),]
d <- dist(t(GSE141256_450K_sex))
hc <- hclust(d, method = "complete") #single, complete, average, ward
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_450K$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_450K$characteristics_ch1.2), cex=1.5)
pdf(here('figs','GSE141256_cluster_sex_450K.pdf'), width=30)
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_450K$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_450K$characteristics_ch1.2), cex=1.5)
dev.off()
## png
## 2
anno_450k<-anno_450k[match(rownames(GSE141256_beta_450K),anno_450k$IlmnID),]
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[which(!(anno_450k$CHR%in%c('X','Y'))),] #485512
filt_sex<-nrow(GSE141256_beta_450K)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_450K),"Probes available: ",nrow(GSE141256_beta_450K),sep=""))
## [1] "Samples available: 52Probes available: 473864"
Some probes have been found to cross-hybridize with other chromosomes (Price et al. 2013 Epigenetics). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL16304
price<-read.table(here("data","GPL16304-47833.txt"), sep='\t', header=T, skip=22)
price<-price[match(rownames(GSE141256_beta_450K),price$ID),]
cross_hyb<-price[which(price$XY_Hits=="XY_YES" | price$Autosomal_Hits=="A_YES"),]
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[which(!(rownames(GSE141256_beta_450K)%in%cross_hyb$ID)),]
filt_cross<-nrow(GSE141256_beta_450K)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_450K),"Probes available: ",nrow(GSE141256_beta_450K),sep=""))
## [1] "Samples available: 52Probes available: 433274"
Polymorphic probes
SnpatCpG<-price[which(price$Target.CpG.SNP!=""),] # 20696
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[which(!(rownames(GSE141256_beta_450K)%in%SnpatCpG$ID)),]
filt_poly<-nrow(GSE141256_beta_450K)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_450K),"Probes available: ",nrow(GSE141256_beta_450K),sep=""))
## [1] "Samples available: 52Probes available: 415080"
Remove probes with high NA count
na_count_probe <-sapply(1:nrow(GSE141256_beta_450K), function(y) length(which(is.na(GSE141256_beta_450K[y,]))))
na_count_probe_good<-which(na_count_probe<(ncol(GSE141256_beta_450K)*0.05))
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[na_count_probe_good,]
filt_bead<-nrow(GSE141256_beta_450K)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_450K),"Probes available: ",nrow(GSE141256_beta_450K),sep=""))
## [1] "Samples available: 52Probes available: 415080"
Remove probes with high detection p value across samples, and any samples with many high detection p value probes
detP <- detectionP(rgset_450k)
failed <- detP>0.05
bad_det_p<-names(which(rowMeans(failed)>0.01))
bad_det_psamp<-names(which(colMeans(failed)>0.01))
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[which(!(rownames(GSE141256_beta_450K)%in%bad_det_p)),]
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[,which(!(colnames(GSE141256_beta_450K)%in%bad_det_psamp))]
filt_detp<-nrow(GSE141256_beta_450K)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_450K),"Probes available: ",nrow(GSE141256_beta_450K),sep=""))
## [1] "Samples available: 52Probes available: 413615"
# Clustering By sample site
# remove rows with NAs
GSE141256_EPIC_betas_cluster<-GSE141256_beta_EPIC[complete.cases(GSE141256_beta_EPIC),]
d <- dist(t(GSE141256_EPIC_betas_cluster))
hc <- hclust(d, method = "complete") #single, complete, average, ward
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_EPIC$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_EPIC$description), cex=1.5)
pdf(here('figs','GSE141256_cluster_wholeEPIC_organoid.pdf'), width=30)
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_EPIC$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_EPIC$description), cex=1.5)
dev.off()
## png
## 2
#Genotyping Probes
SNPs <- getSnpBeta(rgset_EPIC)
SNPs<-SNPs[complete.cases(SNPs),]
SNPs<-SNPs[,which(colnames(SNPs)%in%GSE141256_meta_EPIC$Assay.Name)]
identical(colnames(SNPs),GSE141256_meta_EPIC$Assay.Name)
## [1] TRUE
d <- dist(t(SNPs))
hc <- hclust(d, method = "complete") #single, complete, average, ward
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_EPIC$geo_accession, lab.col=as.fumeric(as.character(GSE141256_meta_EPIC$description)), cex=1.5)
pdf(here('figs','GSE141256_cluster_snps_EPIC.pdf'), width=30)
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_EPIC$geo_accession, lab.col=as.fumeric(as.character(GSE141256_meta_EPIC$description)), cex=1.5)
dev.off()
## png
## 2
Using the cg ID to chromosome annotation from illumina https://emea.support.illumina.com/downloads/infinium-methylationepic-v1-0-product-files.html
anno_EPIC<-read.csv(here("data", "MethylationEPIC_v-1-0_B4.csv"), skip=7)
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[which(rownames(GSE141256_beta_EPIC)%in%anno_EPIC$IlmnID),]
anno_EPIC<-anno_EPIC[match(rownames(GSE141256_beta_EPIC),anno_EPIC$IlmnID),]
identical(rownames(GSE141256_beta_EPIC),anno_EPIC$IlmnID)
## [1] TRUE
GSE141256_EPIC_sex<-GSE141256_beta_EPIC[which(anno_EPIC$CHR%in%c('X','Y')),]
d <- dist(t(GSE141256_EPIC_sex))
hc <- hclust(d, method = "complete") #single, complete, average, ward
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_EPIC$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_EPIC$characteristics_ch1.2), cex=1.5)
pdf(here('figs','GSE141256_cluster_sex_EPIC.pdf'), width=30)
myplclust(hc, labels=GSE141256_meta_EPIC$geo_accession, lab.col=as.fumeric(GSE141256_meta_EPIC$characteristics_ch1.2), cex=1.5)
dev.off()
## png
## 2
# SNP probes should already be removed
GSE141256_beta_EPIC <- GSE141256_beta_EPIC[!grepl("rs",rownames(GSE141256_beta_EPIC)), ]
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_EPIC),"\nProbes available: ",nrow(GSE141256_beta_EPIC),sep=""))
## [1] "Samples available: 32\nProbes available: 865859"
anno_EPIC<-anno_EPIC[anno_EPIC$IlmnID%in%rownames(GSE141256_beta_EPIC),]
identical(rownames(GSE141256_beta_EPIC),anno_EPIC$IlmnID)
## [1] TRUE
GSE141256_beta_EPIC <- GSE141256_beta_EPIC[!anno_EPIC$CHR%in%c("X", "Y"), ]
filt_sex<-nrow(GSE141256_beta_EPIC)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_EPIC),"\nProbes available: ",nrow(GSE141256_beta_EPIC),sep=""))
## [1] "Samples available: 32\nProbes available: 846232"
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-016-1066-1 “43,254 cross-reactive probes with ≥ 47 bp homology with an off-target site, of which 15,782 (36.5 %) are new to the EPIC platform” They include this annotated list in their supplement. wget https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1186%2Fs13059-016-1066-1/MediaObjects/13059_2016_1066_MOESM2_ESM.csv
cross_reactive<-read.csv(here("data", "13059_2016_1066_MOESM2_ESM.csv"), stringsAsFactors = F)
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[which(!(rownames(GSE141256_beta_EPIC)%in%cross_reactive$PROBE)),]
filt_cross<-nrow(GSE141256_beta_EPIC)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_EPIC),"\nProbes available: ",nrow(GSE141256_beta_EPIC),sep=""))
## [1] "Samples available: 32\nProbes available: 814600"
For polymorphic probes I will The Pidsley annotation aswell for “Probes overlapping genetic variants at targeted CpG sites.” and “Probes overlapping genetic variants at single base extension sites for Infinium Type I probes” but NOT “Probes with genetic variants overlapping the body of the probe: 48 base pairs for Infinium Type I probes and 49 base pairs for Infinium Type II probes.”
#wget https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1186%2Fs13059-016-1066-1/MediaObjects/13059_2016_1066_MOESM4_ESM.csv
#wget https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1186%2Fs13059-016-1066-1/MediaObjects/13059_2016_1066_MOESM5_ESM.csv
polymorphic<-read.csv(here("data", "13059_2016_1066_MOESM4_ESM.csv"), stringsAsFactors = F)
print(paste("Filtering ",length(unique(polymorphic$PROBE))," polymorphic probes (genetic variants at targeted CpG sites).", sep=""))
## [1] "Filtering 12378 polymorphic probes (genetic variants at targeted CpG sites)."
baseext<-read.csv(here("data", "13059_2016_1066_MOESM5_ESM.csv"), stringsAsFactors = F)
print(paste("Filtering ",length(unique(baseext$PROBE))," polymorphic probes (single base extension sites for Infinium Type I probes).", sep=""))
## [1] "Filtering 413 polymorphic probes (single base extension sites for Infinium Type I probes)."
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[which(!(rownames(GSE141256_beta_EPIC)%in%c(polymorphic$PROBE, baseext$PROBE))),]
filt_poly<-nrow(GSE141256_beta_EPIC)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_EPIC),"\nProbes available: ",nrow(GSE141256_beta_EPIC),sep=""))
## [1] "Samples available: 32\nProbes available: 802848"
Remove probes with high NA count
na_count_probe <-sapply(1:nrow(GSE141256_beta_EPIC), function(y) length(which(is.na(GSE141256_beta_EPIC[y,]))))
na_count_probe_good<-which(na_count_probe<(ncol(GSE141256_beta_EPIC)*0.05))
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[na_count_probe_good,]
filt_bead<-nrow(GSE141256_beta_EPIC)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_EPIC),"\nProbes available: ",nrow(GSE141256_beta_EPIC),sep=""))
## [1] "Samples available: 32\nProbes available: 802848"
Remove probes with high detection p value across samples, and any samples with many high detection p value probes
detP <- detectionP(rgset_EPIC)
detP<-detP[,which(colnames(detP)%in%GSE141256_meta_EPIC$Assay.Name)]
identical(colnames(detP),GSE141256_meta_EPIC$Assay.Name)
## [1] TRUE
failed <- detP>0.05
bad_det_p<-names(which(rowMeans(failed)>0.01))
bad_det_psamp<-names(which(colMeans(failed)>0.01))
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[which(!(rownames(GSE141256_beta_EPIC)%in%bad_det_p)),]
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[,which(!(colnames(GSE141256_beta_EPIC)%in%bad_det_psamp))]
filt_detp<-nrow(GSE141256_beta_EPIC)
print(paste("Samples available: ",ncol(GSE141256_beta_EPIC),"\nProbes available: ",nrow(GSE141256_beta_EPIC),sep=""))
## [1] "Samples available: 32\nProbes available: 800515"
GSE141256_beta_450K<-GSE141256_beta_450K[which(rownames(GSE141256_beta_450K)%in%rownames(GSE141256_beta_EPIC)),]
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[which(rownames(GSE141256_beta_EPIC)%in%rownames(GSE141256_beta_450K)),]
GSE141256_beta_EPIC<-GSE141256_beta_EPIC[match(rownames(GSE141256_beta_450K),rownames(GSE141256_beta_EPIC)),]
identical(rownames(GSE141256_beta_EPIC),rownames(GSE141256_beta_450K))
## [1] TRUE
GSE141256_beta_combo<-cbind(GSE141256_beta_450K,GSE141256_beta_EPIC)
identical(colnames(GSE141256_meta_EPIC),colnames(GSE141256_meta_450K))
## [1] TRUE
GSE141256_meta_combo<-rbind(GSE141256_meta_450K, GSE141256_meta_EPIC)
identical(colnames(GSE141256_beta_combo), GSE141256_meta_combo$Assay.Name)
## [1] TRUE
print(paste("With combining the EPIC and 450K there are ",ncol(GSE141256_beta_combo)," samples and ",nrow(GSE141256_beta_combo)," CpGs",sep=""))
## [1] "With combining the EPIC and 450K there are 84 samples and 384188 CpGs"
Restructure meta
GSE141256_meta_combo$cell_type<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_combo), function(x){strsplit(GSE141256_meta_combo$characteristics_ch1[x],": ")[[1]][[2]]})
GSE141256_meta_combo$age<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_combo), function(x){strsplit(GSE141256_meta_combo$characteristics_ch1.1[x],": ")[[1]][[2]]})
GSE141256_meta_combo$sex<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_combo), function(x){strsplit(GSE141256_meta_combo$characteristics_ch1.2[x],": ")[[1]][[2]]})
GSE141256_meta_combo$batch<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_combo), function(x){strsplit(GSE141256_meta_combo$characteristics_ch1.3[x],": ")[[1]][[2]]})
GSE141256_meta_combo<-GSE141256_meta_combo[,c(1:3,8,9,11,13:18)]
pca_res <- prcomp(t(GSE141256_beta_combo))
Loadings<-as.data.frame(pca_res$x)
vars <- pca_res$sdev^2
Importance<-vars/sum(vars)
GSE141256_meta_combo$age<-as.numeric(GSE141256_meta_combo$age)
meta_categorical <- GSE141256_meta_combo[, c(3,5,7,9,11,12)] # input column numbers in meta that contain categorical variables
meta_continuous <- as.data.frame(GSE141256_meta_combo[, c(8, 10)] ) # input column numbers in meta that contain continuous variables
colnames(meta_categorical) <- c("Sample Site", "Array Type","Sentrix ID", "Cell Type","Sex","Batch")
colnames(meta_continuous) <- c("det_pval", "age")
ord<-1:length(c(colnames(meta_categorical),colnames(meta_continuous)))
# how far do you want the plot to go?
PCs_to_view<-10
suppressWarnings(heat_scree_plot(Loadings, Importance, 2.5, 2.7))
ggsave(here("figs/GSE141256_heat_scree_before_combat.pdf"), suppressWarnings(heat_scree_plot(Loadings, Importance, 2.5, 2.7)),width = 9, height = 6)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_heat_scree_before_combat.jpeg"), suppressWarnings(heat_scree_plot(Loadings, Importance, 2.5, 2.7)),width = 9, height = 6)
impute 0 and 1
GSE141256_beta_combo[GSE141256_beta_combo==0]<-0.01
GSE141256_beta_combo[GSE141256_beta_combo==1]<-0.99
impute NA
imputeMedianv3<-function(x) apply(x, 1, function(x){x[is.na(x)]<-median(x, na.rm=T); x}) #impute with row mean
GSE141256_beta_combo<-t(imputeMedianv3(GSE141256_beta_combo))
Mval<-function(beta) log2(beta/(1-beta))
edata = apply(GSE141256_beta_combo, 1, Mval) # need mvalues for combat
edata = as.data.frame(edata)
edata = t(edata)
batch = GSE141256_meta_combo$platform_id
combat_GSE141256_mval = ComBat(dat=edata, batch=batch, mod=NULL, par.prior=TRUE)
## Found2batches
## Adjusting for0covariate(s) or covariate level(s)
## Standardizing Data across genes
## Fitting L/S model and finding priors
## Finding parametric adjustments
## Adjusting the Data
Back to betas
betas<-function(M) 2^M/((2^M)+1)
combat_GSE141256_Beta = apply(combat_GSE141256_mval, 1, betas) # need mvalues for combat
combat_GSE141256_Beta = as.data.frame(combat_GSE141256_Beta)
combat_GSE141256_Beta = t(combat_GSE141256_Beta)
combat_GSE141256_Beta<-as.data.frame(combat_GSE141256_Beta)
combat_GSE141256_Beta<-t(imputeMedianv3(combat_GSE141256_Beta))
save(combat_GSE141256_Beta, GSE141256_meta_combo, file=paste(here("data"),"/GSE141256_beta_organoids.RData",sep=""))
#load(here("data","GSE141256_beta_organoids.RData"))
# PCA on batch corrected data
pca_res <- prcomp(t(combat_GSE141256_Beta))
Loadings<-as.data.frame(pca_res$x)
vars <- pca_res$sdev^2
Importance<-vars/sum(vars)
meta_categorical <- GSE141256_meta_combo[, c(3,5,7,9,11,12)] # input column numbers in meta that contain categorical variables
meta_continuous <- as.data.frame(GSE141256_meta_combo[, c(8, 10)] ) # input column numbers in meta that contain continuous variables
colnames(meta_categorical) <- c("Sample Site", "Array Type","Sentrix ID", "Cell Type","Sex","Batch")
colnames(meta_continuous) <- c("det_pval", "age")
ord<-1:length(c(colnames(meta_categorical),colnames(meta_continuous)))
# how far do you want the plot to go?
PCs_to_view<-10
suppressWarnings(heat_scree_plot(Loadings, Importance, 2.5, 2.7))
ggsave(here("figs/GSE141256_heat_scree_after_combat.pdf"), suppressWarnings(heat_scree_plot(Loadings, Importance, 2.5, 2.7)),width = 9, height = 6)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_heat_scree_after_combat.jpeg"), suppressWarnings(heat_scree_plot(Loadings, Importance, 2.5, 2.7)),width = 9, height = 6)
## PC vs PC plot
Loadings$Assay.Name<-rownames(Loadings)
Loadings_meta<-merge(Loadings, GSE141256_meta_combo, by="Assay.Name")
pc2<-ggplot(Loadings_meta, aes(PC1, PC2, fill=source_name_ch1))+geom_point(shape=21,size=3, color="black")+theme_bw()+
xlab("PC1 (27%)")+ylab("PC2 (26%)")+th+theme(axis.text = element_text(size=12),
axis.title = element_text(size=14),
plot.margin = margin(1, 0.1, 1, 1, "cm"))+
scale_fill_manual(values=c("#1a9850", "cornflowerblue","#e1e1ff","#1347a4","#000192"))
pc1<-ggplot(Loadings_meta, aes(PC1, PC2, fill=cell_type))+geom_point(shape=21,size=3, color="black")+theme_bw()+
xlab("PC1 (27%)")+ylab("PC2 (26%)")+th+theme(axis.text = element_text(size=12),
axis.title = element_text(size=14),
plot.margin = margin(1, 1, 1, 1, "cm"))+
scale_fill_manual(values=c("#35978f","#8c510a","#c7eae5","#dfc27d"))
grid.arrange(pc1, pc2)
Variation<-function(x) {quantile(x, c(0.9), na.rm=T)[[1]]-quantile(x, c(0.1), na.rm=T)[[1]]}
Mval<-function(beta) log2(beta/(1-beta))
## only in spheroids
GSE141256_meta_combo_spheroids<-GSE141256_meta_combo[grep("spheroid", GSE141256_meta_combo$cell_type),]
combat_GSE141256_Beta_spheroids<-combat_GSE141256_Beta[,which(colnames(combat_GSE141256_Beta)%in%GSE141256_meta_combo_spheroids$Assay.Name)]
GSE141256_mval_combo = apply(combat_GSE141256_Beta_spheroids, 1, Mval) # need mvalues for combat
GSE141256_mval_combo = as.data.frame(GSE141256_mval_combo)
GSE141256_mval_combo = t(GSE141256_mval_combo)
ref_range_dnam<-sapply(1:nrow(GSE141256_mval_combo), function(x) Variation(GSE141256_mval_combo[x,]))
GSE141256_beta_VeryVariable<-combat_GSE141256_Beta_spheroids[which(ref_range_dnam>=2.75),]
print(paste("There are ",nrow(GSE141256_beta_VeryVariable), " variable CpGs (10th-90th quantile range in M value >2.75)",sep=""))
## [1] "There are 55379 variable CpGs (10th-90th quantile range in M value >2.75)"
Shared by Leanne Jones
DNAm_GEOcodes<-read.csv(here("data/published_organoids/GSE141256","Lewis.etal.DNAmSamples_Organoids_GEOcodes-1.csv"))
DNAm_GEOcodes$GSM<-gsub(" ","",as.character(DNAm_GEOcodes$GEO.ID))
DNAm_GEOcodes$GSM<-sapply(1:nrow(DNAm_GEOcodes), function(x){paste(strsplit(DNAm_GEOcodes$GSM[x],"")[[1]][1:10], collapse="")})
intersect(DNAm_GEOcodes$GSM, GSE141256_meta_combo_spheroids$geo_accession)
## [1] "GSM4199911" "GSM4199913" "GSM4199914" "GSM4199923" "GSM4199927"
## [6] "GSM4199931" "GSM4199990" "GSM4199974" "GSM4199938" "GSM4199942"
## [11] "GSM4199992" "GSM4199962" "GSM4199949" "GSM4199969" "GSM4199983"
## [16] "GSM4199980" "GSM4199978" "GSM4199986" "GSM4199984" "GSM4199967"
## [21] "GSM4199966"
GSE141256_meta_combo_spheroids<-merge(GSE141256_meta_combo_spheroids, DNAm_GEOcodes[,c(1,7,10)], by.x="geo_accession", by.y="GSM")
GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_factor<-as.factor(as.character(GSE141256_meta_combo_spheroids$Passage.Number))
levels(GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_factor)<-c(11,2,3,3,4,5,7)
GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric<-as.numeric(as.character(GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_factor))
GSE141256_meta_combo_spheroids$passage.or.numeric.factor <- factor(GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_factor, levels = c(11,7,5,4,3,2))
pca_res <- prcomp(t(combat_GSE141256_Beta_spheroids))
Loadings<-as.data.frame(pca_res$x)
vars <- pca_res$sdev^2
Importance<-vars/sum(vars)
Loadings$Assay.Name<-rownames(Loadings)
Loadings_meta<-merge(Loadings, GSE141256_meta_combo_spheroids, by="Assay.Name")
pc1<-ggplot(Loadings_meta, aes(PC1, PC2, fill=source_name_ch1))+geom_point(shape=21,size=3, color="black")+theme_bw()+
xlab(paste("PC1 (",round(Importance[1]*100,0),"%)", sep=""))+ylab(paste("PC2 (",round(Importance[2]*100,0),"%)", sep=""))+th+theme(axis.text = element_text(size=12),
axis.title = element_text(size=14),
plot.margin = margin(1, 0.1, 1, 1, "cm"))+
scale_fill_manual(values=c("#1a9850", "cornflowerblue","#e1e1ff","#1347a4","#000192"))
pc2<-ggplot(Loadings_meta, aes(PC2, PC3, fill=as.factor(passage.or.numeric.factor)))+geom_point(shape=21,size=3, color="black")+theme_bw()+
xlab(paste("PC2 (",round(Importance[2]*100,0),"%)", sep=""))+ylab(paste("PC3 (",round(Importance[3]*100,0),"%)", sep=""))+th+theme(axis.text = element_text(size=12),
axis.title = element_text(size=14),
plot.margin = margin(1, 1, 1, 1, "cm"))+
scale_fill_manual(values=rev(c("#D53E4F", "#F46D43", "#FEE08B", "#ABDDA4","#4CA5B1","#5E4FA2")), name="Passage\nNumber")
grid.arrange(pc1, pc2)
ggsave(here("figs/GSE141256_organoid_PCA.pdf"),grid.arrange(pc1, pc2),width = 3.75, height = 2.5)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_organoid_PCA.jpeg"), grid.arrange(pc1, pc2),width = 7.5, height = 5)
# beta plot variable CpGs
Beta_melted<- melt(GSE141256_beta_VeryVariable)
Beta_Plot<-Beta_melted[which(!(is.na(Beta_melted$value))),]
colnames(Beta_Plot)<-c("CpG","ID","Beta")
Beta_Plot<-merge(Beta_Plot,GSE141256_meta_combo_spheroids, by.x="ID", by.y="Assay.Name")
Beta_Plot$passage.or.numeric.factor <- factor(Beta_Plot$passage_factor, levels = c(11,7,5,4,3,2))
ggplot(Beta_Plot, aes(Beta, color=passage.or.numeric.factor))+
geom_density(size=0.75)+theme_bw()+xlab("DNAm Beta Value")+ylab("Density")+
scale_color_manual(values=rev(c("#D53E4F", "#F46D43", "#FEE08B", "#ABDDA4","#4CA5B1","#5E4FA2")), name="Passage\nNumber")
ggsave(here("figs/GSE141256_variable_CpGs.pdf"),width = 3.75, height = 2.5)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_variable_CpGs.jpeg"), width = 7.5, height = 5)
GSE141256_meta_combo_spheroids_paired<-GSE141256_meta_combo_spheroids[grep("F|H",GSE141256_meta_combo_spheroids$Sample.ID),]
GSE141256_meta_combo_spheroids_paired$individual<-as.factor(as.character(GSE141256_meta_combo_spheroids_paired$Sample.ID))
levels(GSE141256_meta_combo_spheroids_paired$individual)<-c("F","F","H","H","J","K")
GSE141256.organoid_paired<-do.call(rbind,lapply(1:length(unique(GSE141256_meta_combo_spheroids_paired$individual)), function(x){
sample<-as.character(unique(GSE141256_meta_combo_spheroids_paired$individual)[x])
samp<-GSE141256_meta_combo_spheroids_paired[GSE141256_meta_combo_spheroids_paired$individual==sample,]
samp<-samp[order(samp$passage_numeric),]
samp$hilo<-as.factor(as.character(samp$passage_numeric))
if(length(levels(samp$hilo))==2){levels(samp$hilo)<-c("lower","higher")}else{
if(length(levels(samp$hilo))==3){levels(samp$hilo)<-c("lower","higher","highest")}else{
if(length(levels(samp$hilo))==4){levels(samp$hilo)<-c("lowest","lower","higher","highest")}else{samp$hilo<-NA}
}
}
samp
}))
GSE141256_beta_VeryVariable_paird<-GSE141256_beta_VeryVariable[,which(colnames(GSE141256_beta_VeryVariable)%in%GSE141256.organoid_paired$Assay.Name)]
Beta_melted<- melt(GSE141256_beta_VeryVariable_paird)
Beta_Plot<-Beta_melted[which(!(is.na(Beta_melted$value))),]
colnames(Beta_Plot)<-c("CpG","ID","Beta")
Beta_Plot<-merge(Beta_Plot,GSE141256.organoid_paired, by.x="ID", by.y="Assay.Name")
Beta_Plot$individual<-as.character(Beta_Plot$individual)
GSE141256.organoid_paired$individual<-as.character(GSE141256.organoid_paired$individual)
labels<-as.data.frame(tapply(GSE141256.organoid_paired$passage_numeric, GSE141256.organoid_paired$individual, function(x) paste(x, collapse=", ")))
colnames(labels)<-"passge"
labels$individual<-rownames(labels)
ggplot()+
geom_density(aes(Beta,color=hilo, group=ID),Beta_Plot, size=0.75)+theme_bw()+xlab("DNAm Beta Value")+ylab("Density")+
scale_color_manual(values = c ("#9ecae1", "#225ea8", "#081d58"), name="Relative\nPassage\nLevel within\nPatient")+facet_wrap(~individual, nrow=1)+
geom_text(aes(0.75, 2.75, label=passge), data=labels, color="grey20")+th+theme(strip.text = element_text(size = 10),
axis.text=element_text(size=4),
panel.spacing = unit(0.7, "lines"))+th+
scale_x_continuous(breaks = c(0,0.5,1))
ggsave(here("figs","GSE141256_paired_beta.pdf"),width = 5, height = 2.2)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_paired_beta.jpeg"),width = 5, height = 2.2)
GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_prior_ratio<-sapply(1:nrow(GSE141256_meta_combo_spheroids), function(x){
print(x)
converted<-as.numeric(round(GSE141256_beta_VeryVariable[,x]*1000,0))
counts<-rep(1000, length(converted))
res = em(converted, counts, .41, .31, .27, 0.01, .1, .1, .90, .03, .5, .05)
passage_threshold_params(converted, counts, res)
})
## [1] 1
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## [1] -305064.98 0.57 0.29 0.03 0.10 0.19
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## [7] 0.06 0.79 0.07 0.45 0.08
## [1] 15
## [1] "loglik" "Prior(H)" "Prior(U)" "Prior(M)" "Prior(I)" "Mu(U)"
## [7] "Rho(U)" "MU(M)" "Rho(M)" "mu_I" "rho_I"
## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
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## [1] 18
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## [1] 19
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## [1] 20
## [1] "loglik" "Prior(H)" "Prior(U)" "Prior(M)" "Prior(I)" "Mu(U)"
## [7] "Rho(U)" "MU(M)" "Rho(M)" "mu_I" "rho_I"
## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
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## [1] -298552.37 0.58 0.27 0.05 0.10 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.44 0.07
## [1] -298532.87 0.58 0.27 0.05 0.11 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.44 0.07
## [1] -298518.79 0.58 0.27 0.05 0.11 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.44 0.08
## [1] -298509.59 0.57 0.27 0.05 0.11 0.07
## [7] 0.02 0.86 0.04 0.44 0.08
GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_ratio_max<-F
GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_ratio_max[which(GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_prior_ratio>1)]<-T
percent_passing<-round((tapply(GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_ratio_max, GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric, sum)/tapply(GSE141256_meta_combo_spheroids$geo_accession, GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric, length))*100,2)
passed_num<-tapply(GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_ratio_max, GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric, sum)
org_numer<-tapply(GSE141256_meta_combo_spheroids$geo_accession, GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric, length)
df<-data.frame(passage=names(percent_passing), passing=percent_passing, pro_passing=percent_passing/100, count=org_numer, passed_num=passed_num)
df<-cbind(df,(binom.confint(df$passed_num, df$count, method="exact", conf.level=0.95)))
df$upper<-df$upper*100
df$lower<-df$lower*100
print(df)
## passage passing pro_passing count passed_num method x n mean
## 2 2 0.00 0.0000 1 0 exact 0 1 0.0000000
## 3 3 37.50 0.3750 8 3 exact 3 8 0.3750000
## 4 4 0.00 0.0000 4 0 exact 0 4 0.0000000
## 5 5 0.00 0.0000 1 0 exact 0 1 0.0000000
## 7 7 66.67 0.6667 6 4 exact 4 6 0.6666667
## 11 11 0.00 0.0000 1 0 exact 0 1 0.0000000
## lower upper
## 2 0.000000 97.50000
## 3 8.523341 75.51368
## 4 0.000000 60.23646
## 5 0.000000 97.50000
## 7 22.277810 95.67281
## 11 0.000000 97.50000
ggplot(df, aes(as.numeric(as.character(passage)), passing))+
geom_errorbar(aes(ymin=lower, ymax=upper), colour="grey70", width=.25)+
geom_line(color="grey20")+geom_point(size=1.25,shape=21,color="black",aes(fill=passage))+xlab("Passage")+
ylab("Samples with Trimodal\nDistribution (%)")+theme_bw()+theme(axis.title = element_text(size=10))+
scale_fill_manual(values=c("#5E4FA2", "#D53E4F", "#F46D43", "#FEE08B", "#ABDDA4","#4CA5B1"),name="Passage\nNumber", guide=F)+
scale_x_continuous(breaks=c(2,3,4,5,7,11))
ggsave(here("figs","GSE141256_Mixture_model_ratio_threshold_maximize.pdf"), width=3, height=2)
plts_paired<-lapply(1:nrow(GSE141256_meta_combo_spheroids), function(x){#1:nrow(epic.organoid)
print(x)
passage<-paste("passage: ",GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric[x],"\nIndividual: ", GSE141256_meta_combo_spheroids$Sample.ID[x],"\nRatio I/H: ",round(GSE141256_meta_combo_spheroids$thresholded_prior_ratio[x],2), sep="")
converted<-as.numeric(round(GSE141256_beta_VeryVariable[,x]*1000,0))
counts<-rep(1000, length(converted))
res = em(converted, counts, .41, .31, .27, 0.01, .1, .1, .90, .03, .5, .05)
draw_fit_params_gg(converted, counts, res,passage)
})
## [1] 1
## [1] "loglik" "Prior(H)" "Prior(U)" "Prior(M)" "Prior(I)" "Mu(U)"
## [7] "Rho(U)" "MU(M)" "Rho(M)" "mu_I" "rho_I"
## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
## [11] "0.05"
## [1] -311085.51 0.57 0.31 0.10 0.02 0.14
## [7] 0.08 0.86 0.04 0.49 0.05
## [1] -305948.55 0.60 0.31 0.06 0.03 0.16
## [7] 0.08 0.85 0.04 0.49 0.04
## [1] -305335.19 0.61 0.31 0.05 0.04 0.16
## [7] 0.09 0.83 0.04 0.49 0.04
## [1] -305097.01 0.61 0.31 0.04 0.04 0.17
## [7] 0.09 0.82 0.04 0.49 0.04
## [1] -304965.92 0.60 0.31 0.04 0.05 0.17
## [7] 0.09 0.81 0.04 0.49 0.04
## [1] -304874.34 0.60 0.31 0.04 0.06 0.17
## [7] 0.10 0.81 0.04 0.49 0.04
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## [7] 0.10 0.80 0.04 0.49 0.04
## [1] -304732.55 0.58 0.32 0.03 0.07 0.17
## [7] 0.10 0.80 0.04 0.49 0.04
## [1] -304671.13 0.58 0.32 0.03 0.07 0.17
## [7] 0.10 0.79 0.04 0.49 0.04
## [1] -304613.31 0.57 0.32 0.03 0.08 0.17
## [7] 0.10 0.79 0.04 0.49 0.04
## [1] -304558.62 0.56 0.32 0.03 0.08 0.17
## [7] 0.10 0.78 0.04 0.48 0.04
## [1] -304505.89 0.55 0.32 0.04 0.09 0.17
## [7] 0.10 0.78 0.04 0.48 0.04
## [1] -304454.00 0.55 0.32 0.04 0.09 0.17
## [7] 0.10 0.78 0.04 0.48 0.04
## [1] -304401.89 0.54 0.33 0.04 0.10 0.17
## [7] 0.09 0.78 0.04 0.48 0.04
## [1] -304348.74 0.53 0.33 0.04 0.10 0.17
## [7] 0.09 0.77 0.04 0.48 0.05
## [1] -304293.70 0.53 0.33 0.04 0.11 0.17
## [7] 0.09 0.77 0.04 0.48 0.05
## [1] -304236.35 0.52 0.33 0.04 0.11 0.17
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## [7] 0.09 0.77 0.04 0.48 0.05
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## [7] 0.09 0.77 0.04 0.48 0.05
## [1] -304050.57 0.50 0.33 0.05 0.12 0.17
## [7] 0.09 0.77 0.05 0.48 0.05
## [1] -303984.85 0.49 0.33 0.05 0.13 0.17
## [7] 0.09 0.77 0.05 0.48 0.05
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## [1] -303850.35 0.48 0.33 0.05 0.14 0.16
## [7] 0.09 0.77 0.05 0.48 0.05
## [1] -303782.63 0.47 0.33 0.06 0.14 0.16
## [7] 0.09 0.77 0.05 0.48 0.05
## [1] -303715.07 0.46 0.33 0.06 0.14 0.16
## [7] 0.09 0.77 0.05 0.47 0.06
## [1] -303648.12 0.46 0.33 0.06 0.15 0.16
## [7] 0.09 0.77 0.05 0.47 0.06
## [1] -303582.12 0.45 0.33 0.06 0.15 0.16
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.47 0.06
## [1] -303517.31 0.44 0.33 0.06 0.16 0.16
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.47 0.06
## [1] -303453.87 0.44 0.33 0.07 0.16 0.16
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.47 0.06
## [1] -303391.95 0.43 0.33 0.07 0.17 0.16
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.47 0.06
## [1] -303331.61 0.42 0.33 0.07 0.17 0.16
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.47 0.06
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## [7] 0.08 0.77 0.05 0.47 0.06
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## [7] 0.08 0.77 0.05 0.46 0.06
## [1] -303160.29 0.41 0.33 0.08 0.19 0.15
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.46 0.06
## [1] -303106.37 0.40 0.33 0.08 0.19 0.15
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.46 0.06
## [1] -303053.96 0.39 0.33 0.08 0.19 0.15
## [7] 0.08 0.77 0.05 0.46 0.06
## [1] -303003.03 0.39 0.33 0.08 0.20 0.15
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## [1] -302953.51 0.38 0.33 0.09 0.20 0.15
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## [7] 0.07 0.77 0.06 0.46 0.07
## [1] -302812.93 0.36 0.33 0.09 0.22 0.14
## [7] 0.07 0.78 0.06 0.45 0.07
## [1] -302768.58 0.36 0.33 0.09 0.22 0.14
## [7] 0.07 0.78 0.06 0.45 0.07
## [1] -302725.40 0.35 0.33 0.10 0.23 0.14
## [7] 0.07 0.78 0.06 0.45 0.07
## [1] -302683.28 0.34 0.33 0.10 0.23 0.14
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## [7] 0.07 0.78 0.06 0.45 0.07
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## [7] 0.07 0.78 0.06 0.45 0.07
## [1] -302564.04 0.33 0.33 0.10 0.24 0.14
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## [7] 0.07 0.78 0.06 0.44 0.07
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## [7] 0.07 0.78 0.06 0.44 0.07
## [1] -302453.78 0.31 0.32 0.11 0.26 0.13
## [7] 0.07 0.78 0.06 0.44 0.07
## [1] -302419.02 0.30 0.32 0.11 0.26 0.13
## [7] 0.06 0.78 0.06 0.44 0.07
## [1] -302385.23 0.30 0.32 0.11 0.27 0.13
## [7] 0.06 0.78 0.06 0.44 0.07
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## [1] -302320.50 0.29 0.32 0.12 0.28 0.13
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## [1] -302289.54 0.28 0.32 0.12 0.28 0.13
## [7] 0.06 0.78 0.06 0.44 0.08
## [1] -302259.52 0.28 0.32 0.12 0.28 0.13
## [7] 0.06 0.78 0.06 0.43 0.08
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## [7] 0.06 0.78 0.07 0.43 0.08
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## [7] 0.06 0.78 0.07 0.43 0.08
## [1] -302174.95 0.26 0.31 0.13 0.30 0.12
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## [1] -302123.15 0.25 0.31 0.13 0.31 0.12
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## [7] 0.06 0.77 0.07 0.43 0.08
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## [1] 2
## [1] "loglik" "Prior(H)" "Prior(U)" "Prior(M)" "Prior(I)" "Mu(U)"
## [7] "Rho(U)" "MU(M)" "Rho(M)" "mu_I" "rho_I"
## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
## [11] "0.05"
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## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
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## [7] "Rho(U)" "MU(M)" "Rho(M)" "mu_I" "rho_I"
## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
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## [1] 17
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## [1] -301536.80 0.24 0.28 0.12 0.36 0.10
## [7] 0.04 0.79 0.07 0.40 0.10
## [1] -301527.12 0.24 0.28 0.12 0.36 0.10
## [7] 0.04 0.79 0.07 0.40 0.10
## [1] 21
## [1] "loglik" "Prior(H)" "Prior(U)" "Prior(M)" "Prior(I)" "Mu(U)"
## [7] "Rho(U)" "MU(M)" "Rho(M)" "mu_I" "rho_I"
## [1] "XXX" "0.41" "0.31" "0.27" "0.01" "0.1" "0.1" "0.9" "0.03" "0.5"
## [11] "0.05"
## [1] -304640.77 0.51 0.35 0.12 0.02 0.11
## [7] 0.07 0.88 0.04 0.50 0.04
## [1] -301891.31 0.54 0.34 0.09 0.02 0.11
## [7] 0.06 0.86 0.04 0.50 0.04
## [1] -301332.16 0.56 0.33 0.08 0.03 0.10
## [7] 0.05 0.86 0.04 0.50 0.04
## [1] -300924.66 0.57 0.32 0.07 0.04 0.09
## [7] 0.05 0.85 0.04 0.50 0.04
## [1] -300555.26 0.58 0.31 0.06 0.05 0.09
## [7] 0.04 0.85 0.04 0.49 0.04
## [1] -300221.28 0.59 0.30 0.06 0.05 0.08
## [7] 0.03 0.85 0.04 0.49 0.04
## [1] -299937.50 0.59 0.29 0.06 0.06 0.08
## [7] 0.03 0.85 0.04 0.48 0.04
## [1] -299711.53 0.60 0.29 0.05 0.06 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.48 0.04
## [1] -299536.08 0.60 0.28 0.05 0.07 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.48 0.04
## [1] -299396.34 0.60 0.28 0.05 0.07 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.47 0.04
## [1] -299276.59 0.60 0.27 0.05 0.08 0.07
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## [1] -299169.04 0.60 0.27 0.05 0.08 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.46 0.05
## [1] -299070.20 0.60 0.27 0.05 0.08 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.46 0.05
## [1] -298979.25 0.60 0.27 0.05 0.09 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.46 0.05
## [1] -298896.89 0.60 0.27 0.05 0.09 0.07
## [7] 0.02 0.85 0.04 0.45 0.06
## [1] -298822.85 0.60 0.27 0.05 0.09 0.07
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## [7] 0.02 0.85 0.04 0.44 0.07
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## [7] 0.02 0.85 0.04 0.44 0.08
## [1] -298509.59 0.57 0.27 0.05 0.11 0.07
## [7] 0.02 0.86 0.04 0.44 0.08
plts_paired_order<-plts_paired[order(GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric)]
pdf(here("figs","GSE141256_organoids_thresholding_all_samples.pdf"))
plts_paired_order
## [[1]]
##
## [[2]]
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## [[3]]
##
## [[4]]
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## [[5]]
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## [[6]]
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## [[7]]
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## [[8]]
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## [[10]]
## Warning: Removed 2 rows containing missing values (geom_bar).
##
## [[11]]
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## [[12]]
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## [[13]]
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## [[14]]
## Warning: Removed 2 rows containing missing values (geom_bar).
##
## [[15]]
## Warning: Removed 1 rows containing missing values (geom_bar).
##
## [[16]]
## Warning: Removed 3 rows containing missing values (geom_bar).
##
## [[17]]
##
## [[18]]
##
## [[19]]
##
## [[20]]
##
## [[21]]
## Warning: Removed 3 rows containing missing values (geom_bar).
dev.off()
## png
## 2
mod<-model.matrix(~ 0 + passage_numeric, data=GSE141256_meta_combo_spheroids)
fit <- lmFit(combat_GSE141256_Beta_spheroids, mod)
ebfit <- eBayes(fit)
# covariate adjusted beta values
beta<-combat_GSE141256_Beta_spheroids
passage_db<-sapply(1:nrow(beta), function(x){
sampleinfo_cpg<-GSE141256_meta_combo_spheroids
sampleinfo_cpg$beta<-as.numeric(beta[x,])
fit<-lm(beta ~ passage_numeric, data=sampleinfo_cpg)
pval<-summary(fit)$coef["passage_numeric","Pr(>|t|)"]
slope<-fit$coefficients[2]
(min(GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric)*slope) - (max(GSE141256_meta_combo_spheroids$passage_numeric)*slope)})
passage_GSE141256<-data.frame(p.value=ebfit$p.value[,"passage_numeric"], CpG=rownames(beta), db=passage_db)
# Adjust P values
passage_GSE141256$p_adjusted<-p.adjust(passage_GSE141256$p.value, method="BH")
diff_CpG_dbGSE141256<-passage_GSE141256[which(passage_GSE141256$p_adjusted<0.05 & abs(passage_GSE141256$db)>0.15),] #25086
diff_CpG_db_hypoGSE141256<-diff_CpG_dbGSE141256$CpG[which((diff_CpG_dbGSE141256$db)>=0.15)] # 17419
diff_CpG_db_hyperGSE141256<-diff_CpG_dbGSE141256$CpG[which((diff_CpG_dbGSE141256$db)<=(-0.15))] # 7667
load(here("data","beta_organoids.RData"))
pvals_long<-read.csv(here("data","Heteroskedactiy_pvalues_FDR_1000iter.csv"), header=T)
pvals_long[,1]<-NULL
colnames(pvals_long)<-c("BP_count","diff_count","mean_db","fdr_BP","fdr_diff")
pvals_long$CpG<-rownames(organoid_beta)
pvals_long$BP_pval<-((1000-pvals_long$BP_count)+1)/1001
pvals_long$diff_pval<-((1000-pvals_long$diff_count)+1)/1001
pvals_long$BP_fdr<-((1000-pvals_long$fdr_BP)+1)/1001
pvals_long$diff_fdr<-((1000-pvals_long$fdr_diff)+1)/1001
hetero_CpG<-rownames(organoid_beta)[which(pvals_long$BP_fdr<0.05)]
print(paste("CpGs with significant (adjusted p<0.05) heteroskedactiy: ", length(hetero_CpG), sep=""))
## [1] "CpGs with significant (adjusted p<0.05) heteroskedactiy: 41852"
diff_CpG<-rownames(organoid_beta)[which(pvals_long$diff_fdr<0.05)]
diff_CpG_db<-pvals_long[which(pvals_long$diff_fdr<0.05 & abs(pvals_long$mean_db)>0.15),]
print(paste("CpGs with significant (adjusted p<0.05; delta beta >0.05) differential methylation: ", nrow(diff_CpG_db), sep=""))
## [1] "CpGs with significant (adjusted p<0.05; delta beta >0.05) differential methylation: 23766"
diff_CpG_db_hypo<-diff_CpG_db$CpG[which((diff_CpG_db$mean_db)>=0.15)] # 11772
diff_CpG_db_hyper<-diff_CpG_db$CpG[which((diff_CpG_db$mean_db)<=(-0.15))] # 5214
How many differential CpGs could overlap? 450K vs EPIC
print(paste("Of the ", nrow(diff_CpG_db), " CpGs differential with passage in the original organoids, ",
length(diff_CpG_db$CpG[which(diff_CpG_db$CpG%in%rownames(combat_GSE141256_Beta_spheroids))]), " are in the GSE141256 data", sep=""))
## [1] "Of the 23766 CpGs differential with passage in the original organoids, 7673 are in the GSE141256 data"
diff_CpG_db_hypo_overlap<-diff_CpG_db_hypo[which(diff_CpG_db_hypo%in%rownames(combat_GSE141256_Beta_spheroids))]
diff_CpG_db_hyper_overlap<-diff_CpG_db_hyper[which(diff_CpG_db_hyper%in%rownames(combat_GSE141256_Beta_spheroids))]
diff_CpG_db_hypoGSE141256_overlap<-diff_CpG_db_hypoGSE141256[which(diff_CpG_db_hypoGSE141256%in%pvals_long$CpG)]
diff_CpG_db_hyperGSE141256_overlap<-diff_CpG_db_hyperGSE141256[which(diff_CpG_db_hyperGSE141256%in%pvals_long$CpG)]
print(paste("Of the ",length(diff_CpG_db_hypo_overlap)," hypo CpGs also on the 450K ",
length(intersect(diff_CpG_db_hypoGSE141256_overlap, diff_CpG_db_hypo_overlap))," are also hypo in the GSE141256 cohort (",
round((length(intersect(diff_CpG_db_hypoGSE141256_overlap, diff_CpG_db_hypo_overlap))/length(diff_CpG_db_hypo_overlap))*100,2),"%)",sep=""))
## [1] "Of the 5129 hypo CpGs also on the 450K 3503 are also hypo in the GSE141256 cohort (68.3%)"
print(paste("Of the ",length(diff_CpG_db_hyper_overlap)," hypo CpGs also on the 450K ",
length(intersect(diff_CpG_db_hyperGSE141256_overlap, diff_CpG_db_hyper_overlap))," are also hypo in the GSE141256 cohort (",
round((length(intersect(diff_CpG_db_hyperGSE141256_overlap, diff_CpG_db_hyper_overlap))/length(diff_CpG_db_hyper_overlap))*100,2),"%)",sep=""))
## [1] "Of the 2544 hypo CpGs also on the 450K 1117 are also hypo in the GSE141256 cohort (43.91%)"
plt_db_direction<-merge(pvals_long[,c(3,6)], passage_GSE141256, by="CpG")# 380776
plt_db_direction$sig<-"Not Significant"
plt_db_direction$sig[which(plt_db_direction$CpG%in%c(intersect(diff_CpG_db_hypoGSE141256_overlap, diff_CpG_db_hypo_overlap),intersect(diff_CpG_db_hyperGSE141256_overlap, diff_CpG_db_hyper_overlap)))]<-"Significant\nIn Both\nCohorts"
ggplot(plt_db_direction, aes(mean_db, db))+geom_point(aes(color=sig, alpha=sig),shape=19)+th+theme_bw()+
scale_color_manual(values=c("lightgrey", "cornflowerblue"), name="Significant\nWith Passage")+
scale_alpha_manual(values=c(0.25,1), guide=F)+
geom_hline(yintercept=c(-0.15,0.15), color="grey60")+geom_vline(xintercept=c(-0.15,0.15), color="grey60")+
ylim(-0.8,0.8)+xlim(-0.8,0.8)+xlab("Cohort 1 Organoid\nPassage Delta Beta")+ylab("Cohort 3 Organoid\nPassage Delta Beta")+
stat_smooth(method="lm", se=F, color="black")
## Warning: Removed 68 rows containing non-finite values (stat_smooth).
## Warning: Removed 68 rows containing missing values (geom_point).
#ggsave(here("figs","GSE141256_db_directionality.pdf"), width=5, height=3.75)
ggsave(here("figs/jpeg","GSE141256_db_directionality.jpeg"), width=5, height=3.75)
## Warning: Removed 68 rows containing non-finite values (stat_smooth).
## Warning: Removed 68 rows containing missing values (geom_point).
print(paste("Correlation of delta betas between cohorts: ", round(cor(plt_db_direction$db, plt_db_direction$mean_db),2), sep=""))
## [1] "Correlation of delta betas between cohorts: 0.27"
epic.organoid_minimal<-epic.organoid[,c(2, 14, 17)]
colnames(epic.organoid_minimal)[1]<-"Assay.Name"
epic.organoid_minimal$cohort<-"Cohort 1 Organoids"
GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal<-GSE141256_meta_combo_spheroids[,c(6,13,16)]
GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal$cohort<-"Cohort 3 Organoids"
colnames(GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal)[2:3]<-c("sample_ID","passage.or.rescope.no_numeric")
GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal$sample_ID[grep("H", GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal$sample_ID)]<-"H"
GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal$sample_ID[grep("F", GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal$sample_ID)]<-"F"
sample_info_both<-rbind(GSE141256_meta_combo_spheroids_minimal,epic.organoid_minimal)
plt_hetero_GSE141256<-function(CpGs, legend, axislab, title){
betas<-melt(cbind(combat_GSE141256_Beta_spheroids[CpGs,],organoid_beta[CpGs,]))
organoid_plt<-merge(sample_info_both, betas, by.x="Assay.Name",by.y="Var2")
p<-ggplot(organoid_plt, aes(passage.or.rescope.no_numeric,value))+
geom_line(aes(group=sample_ID),color="lightgrey")+
stat_smooth(method="lm", color="grey30", size=0.7, se=F)+th+theme_bw()+
geom_point(aes(fill=as.factor(passage.or.rescope.no_numeric)),shape=21, size=1.25)+
scale_fill_manual(values=pass_col,name="Passage\nNumber", drop=T)+
facet_grid(cohort~Var1)+
ylab("DNAm Beta")+xlab("Passage Number")+ylim(0,1)+
theme(plot.margin = margin(0.5, 0.15, 0.5, 0.15, "cm"),plot.title = element_text(size=12))+
xlim(1,16)
if(missing(legend) & missing(axislab) & missing(title)){p}else{
if(legend=="N" & axislab=="N"){p + theme(legend.position = "none",axis.title.y=element_blank(),
axis.text.y=element_blank(),
axis.ticks.y=element_blank())+ ggtitle(title)}else{
if(legend=="N" & axislab=="Y"){p + theme(legend.position = "none") + ggtitle(title)}}}}
plt_hetero_GSE141256(c("cg25402228","cg22009751"))
## Warning: Removed 10 rows containing missing values (geom_smooth).
ggsave(here("figs","Passage_differential_CpGs_GSE141256.pdf"),width = 4.75, height = 4)
## Warning: Removed 10 rows containing missing values (geom_smooth).
ggsave(here("figs/jpeg","Passage_differential_CpGs_GSE141256.jpeg"), width = 4.75, height = 4)
## Warning: Removed 10 rows containing missing values (geom_smooth).
sessionInfo()
## R version 3.5.1 (2018-07-02)
## Platform: x86_64-conda_cos6-linux-gnu (64-bit)
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## locale:
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## [1] splines stats4 parallel stats graphics grDevices utils
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